PROTAC是由三部分组成的异型双功能分子，近些年来，PROTACs的研发非常火热，国内外企业纷纷布局，包括Arvinas，C4 Therapeutics，Kymera Therapeutics，海思科、恒瑞医药和百济神州。不仅如此，国外制药巨头罗氏、辉瑞、拜耳、默沙东、GSK、诺华、阿斯利康等纷纷加码PROTAC领域。

PROTAC相对于小分子有很多优点，比如提高选择性，解决耐药性，靶向不可成药靶点和消除整个蛋白（不仅抑制酶功能）等，但是也存在很多缺点，由于PROTAC一般分子量比较大导致溶解度差，口服生物利用度差以及透膜性差等。

Edmonson等人评估了几种不同的E3连接酶成药性，发现CRBN配体成药性最佳，为了改善PROTAC的成药性，人们进行了很多优化，包括E3连接酶配体、连接链以及其它化学和制剂方法。

肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，占所有癌症的近20%死亡。NSCLC患者含有的基因突变主要包括EGFR，ALK，ROS1，BRAF或MET等，他们接受小分子抑制剂靶向治疗作为一线治疗，但是这些小分子抑制剂很有可能出现耐药问题，为了进一步解决这些耐药性问题，人们开发不同的PROTACs，希望能用于肺癌领域治疗。

1 PROTAC的开发和挑战

PROTAC是由三部分组成的异型双功能分子：目标蛋白（POI）的配体和E3泛素连接酶的配体以及连接这两部分的接头（图1A）。

目标蛋白的配体将进入细胞过程如图1B所示。（1）PROTAC穿透细胞;（2）一方面，PROTAC与POI形成二元复合物，另一方面与E3泛素连接酶形成二元复合物;（3）POI与E3泛素连接酶之间的PPI（正协同性）促进三元复合物的形成;（4）一旦形成三元复合物，E3泛素连接酶会将泛素（通过E2连接酶）转移到感兴趣的蛋白质上;（5）因此，蛋白质将被送到蛋白酶体，蛋白酶体将进行蛋白水解。然后将蛋白质分割成氨基酸片段，这些片段将被细胞回收；（6） PROTAC可以回收用于后续几轮降解[1]。

图1. PROTAC示意图

在过去的几年中，PROTAC为工业界和学术界带来了前所未有的机遇。其中进展最快的是Arvinas的雄激素受体（AR）降解剂化合物1（ARV-110）和雌激素受体（ER）降解剂化合物2（ARV-471），进入临床II期分别用于去势抵抗性前列腺癌和 ER+/HER2− 乳腺癌治疗（NCT03888612和NCT04072952）（图2）[2]。

图2. ARV110和ARV-471的结构

除此之外，最近两年进入临床研究的PROTAC如图3所示。而且，目前已经有两个PROTAC数据库：PROTACpedia（http://protacdb.weizmann.ac.il/ptcb/

stats）和PROTAC-DB 2.0（http://cadd。zju.edu.cn/protacdb/）。

图3. 近两年进入临床的PROTACs

PROTAC相对于小分子有很多优点，比如提高选择性，解决耐药性，靶向不可成药靶点和消除整个蛋白（不仅抑制酶功能）等，但是也存在很多缺点，由于PROTAC一般分子量比较大导致溶解度差，口服生物利用度差以及透膜性差等。

Edmonson等人评估了与化合物渗透性/吸收相关的PROTAC的几种物理化学描述，包括分子量（MW）、亲脂性（cLogP，cLogD）、H键供体（HBD）、H键受体（HBA）、极性表面积（PSA）、可旋转键数（nRotB）、违反Lipinski规则5（Nrule-of-5）的数量和使用cLogD计算的AB-MPS值，芳环数（nAr）和根据公式 AB-MPS = Abs（cLogD 3）+ nAr + nR otB）计算的可旋转键数（nRotB）; AB-MPS 分数越低，化合物被吸收的可能性就越大，数值 < 14 表示口服吸收概率越高。

平均而言，VHL PROTACs的AB-MPS和Nrule-of-5评分仍然很高，表明口服吸收的可能性较低。由于其E3泛素连接酶配体的独特起始性质，CRBN-PROTACs在口服吸收方面处于更合适的化学空间。它们的MW可以降至700以下，并且具有合理的药物亲脂性和降低的HBD/nRotB数量（图4）[1]。

图4.根据法则5（Ro5）进行比较

2 优化策略

1 E3连接酶配体的优化

PROTACs最常用的E3连接酶是VHL和CRBN。近些年来，人们也在开发不同的E3连接酶用于PROTAC设计，如2021年，Ishida等人专注于发现用于PROTAC的新型E3泛素连接酶的新方法。这些方法包括分子建模方法，例如基于晶体学数据收集信息的SBDD和FBDD方法、基于活性的蛋白质分析（ABPP）筛查或表型筛查。通过这些方法他们发现一些可以用于PROTACs设计的E3连接酶（图5）[1]。

图5.尚未探索用于PROTAC应用的E3泛素连接酶列表

E3连接酶VHL常用的配体如图6中化合物3所示，经过不断的优化和探索，人们从化合物3的三个不同部位（Exit vector 1-3）连接不同的连接链来设计PROTACs，如SMARC22的降解剂16和17。

图6. VHL配体和SMARCA2降解剂结构

CRBN常见的配体结构如图7中化合物5，可以从化合物5苯环上的邻位间位连接不同的连接链如酰胺，炔基和醚等设计不同的PROTACs。

图7. CRBN配体以及以CRBN配体设计的PROTACs结构

由于CRBN的分子量小和AB-MPS数值小等优点，近年来，人们也不断探索发现新型CRBN配体，用来改善PROTACs和分子胶的成药性（图8）[1]。

图8. 新型CRBN配体结构

2 连接链优化

PROTACs的类药性有时可以通过接头修饰得到显着改善，这些接头修饰可以改变HBD，亲脂性，分子量，可旋转键和极性表面区域。

接头的HBD对细胞膜通透能力的影响已在BET降解剂中进行了评估。BET降解剂MZ1和ARV-771的酰胺键被酯基团取代，减少一个HBD和亲脂性，分别提高了PAMPA渗透性和ALogP，并显示出改善的降解活性（pDC50）（图9）[3]。

图9. BET降解剂的连接链优化

常用的接头如图10所示，有柔性接头如碳链，PEG，炔烃和酰胺等，也有刚性接头如哌嗪，哌啶，吡唑和三氮唑等。

图10. 常用的接头结构

3 其它优化方法

除了E3连接酶配体，接头的修饰之外，还有一些其它的修饰方法可以增加它们的细胞透膜性，优化它们的成药性，如CLIPTACs，前药，细胞穿透肽（CPP）和纳米粒子等（图11）[4]。

图11. PROTAC递送到细胞内

3 PROTACs用于肺癌领域的治疗

肺癌仍然是癌症死亡的主要原因，占所有癌症的近20%死亡。在所有被诊断患有肺癌的患者中，只有10%至20%的生存率为 > 5年，死于肺癌的人数多于死于乳腺癌、结肠癌和前列腺癌的总和。

肺癌分为两种主要组织学类型：小细胞肺癌（SCLC），约占所有肺癌的15%，以及非小细胞肺癌（NSCLC），约占85%。

NSCLC患者含有的基因突变主要包括EGFR，ALK，ROS1，BRAF或MET等，他们接受小分子抑制剂靶向治疗作为一线治疗，而没有驱动突变的患者可以接受细胞毒性化疗和免疫治疗联合治疗或单独免疫治疗。然而，大多数表现为晚期疾病最终通过克隆选择耐药肿瘤细胞来发展肿瘤进展，迫切需要克服耐药性的新策略来改善患者治疗结果。

PROTACs作为肺部癌症新型疗法和克服耐药性的新策略正在迅速发展。已经开发了多种PROTAC分子，用于NSCLC中经过验证的治疗靶点，例如EGFR，KRAS，ALK，BRAF和BCL-XL，它们在细胞模型和临床前肿瘤模型显示有效。EGFR-PROTAC用于治疗肺癌。

1 EGFR-PROTACs

EGFR作为一种跨膜蛋白，属于EGF家族的成员，是一种受体酪氨酸激酶（RTK）。EGFR在人上皮细胞的信号转导途径中起关键作用，并参与细胞增殖、侵袭、凋亡和血管生成。

EGFR由28个外显子和27个内含子组成，编码1186个氨基酸，其糖基化单体具有∼170 kDa分子量。EGFR的结构包括三个组成部分：细胞外结构域（两个配体结合结构域和两个富含半胱氨酸的结构域），跨膜结构域和细胞内结构域（酪氨酸激酶结构域和具有多个自磷酸化位点羧基末端尾部）（图12）。

EGFR突变，包括外显子18-25中的点突变、缺失和插入，可将蛋白质结构的平衡从非活性状态转变为活性状态，导致EGFR和其他HER家族蛋白在没有配体刺激的情况下过度磷酸化。特别是外显子19和L858R点突变的缺失突变分别位于激酶活性位点裂和激酶活化环附近，占所有EGFR突变的~85%[5]。

图12. EGFR结构与突变类型

目前EGFR靶向小分子药已经发展了4代，1-3代靶向药已经在患者中广泛应用，而第四代靶向药正已经在进行临床试验。

第一代药物包括吉非替尼，厄洛替尼和埃克替尼；第二代药物包括阿法替尼和达可替尼；第三代药物包括奥希替尼，阿美替尼和伏美替尼。使用这些药物不可避免会产生耐药性突变，第三代药物主要的耐药突变也是C797S，这需要第四代EGFR靶向药克服，前三代抑制剂都是靶向催化位点，第四代是靶向变构位点。在研第四代药物非常多，不过多数处于早期研究阶段，目前只有两个药物发表了初步的人体试验数据，分别是BLU-945和BBT-176。

EGFR的耐药机制分为EGFR依赖性耐药机制和EGFR非依赖性耐药机制。EGFR依赖性耐药机制即是由EGFR自身的改变而造成的，包括T790M突变，C797X突变，G796R，G796S和G796D溶剂前沿突变，涉及18外显子的L718Q，G719C/S/A和G724S突变，涉及21外显子的G834L突变，野生型EGFR基因扩增等[6]。

图2.EGFR依赖性耐药机制

人们开发EGFR的PROTACs希望能解决这些耐药性问题，已经有一些EGFR的PROTACs进入临床研究，如海思科的HSK40118等。表1列出临床前在研的EGFR的PROTACs用于肺癌疾病的治疗。

表1. 临床前的EGFR的PROTACs

2 ALK-PROTACs

ALK融合癌基因在约3%-5%的NSCLC中检测到，发生在非吸烟者或既往吸烟者以及年龄较小的人群中. EML4-ALK融合是最重要的ALK融合和经验证的致癌驱动因素。ALK抑制剂是ALK重排肺癌患者的一线治疗。迄今为止，三代ALK抑制剂已获得FDA批准。第二代ALK TKI，如阿来替尼和布格替尼，优于第一代ALK抑制剂克唑替尼。

与克唑替尼相比，阿来替尼在脑转移瘤的治疗方面也显示出改善的结果。NSCLC通过在ALK酪氨酸激酶结构域内获得继发突变，ALK融合基因的扩增或旁路信号通路的激活而对ALK TKI产生耐药性。劳拉替尼是第三代ALK TKI，用于前几代进展的患者。它具有对抗大多数已知的ALK抑制剂抗性突变（如G1202R）的活性。然而，患者也可能对劳拉替尼产生耐药性。

针对这些耐药问题，人们开发不同的ALK的PROTACs，希望能解决这些耐药性问题（表2）。

表2. 临床前的ALK的PROTACs

3 其它靶点的PROTACs

除了EGFR和ALK的PROTACs，还有很多其它靶点的PROTACs也在肺癌细胞中有效，如KRAS，SOS1，BRAF，BET，SHP2和FAK等，具体见表3。

表3. 其它靶点的临床前的PROTACs

— 小结 —

PROTAC作为一个热门领域，近几年受到投资者和学术界广泛关注，除了PROTAC之外，也有很多其它相关的技术被发现，如LYTAC（代表公司Lycia Therapeutics），分子胶（Monte Rosa Therapeutics），CHAMP（代表公司Ranok Therapeutics），ATAC（代表公司Avilar Therapeutics），ATTEC（代表公司PAQ Therapeutics），单价蛋白降解剂（代表公司Dunad Therapeutics）和AnDC（代表公司Orum Therapeutics）等。

目前PROTAC领域进展最快的是Arvinas的ARV-110和ARV-471，但是包括PROTACs在内这些新兴的技术都没有药物成功上市，究竟它们能解决一些问题如耐药性还是昙花一现，让我们拭目以待。

参考文献：

1. Nicolas Guedeney, Marie Cornu, Florian Schwalen, Charline Kieffer, Anne Sophie Voisin-Chiret, PROTAC technology: A new drug design for chemical biology with many challenges in drug discovery, Drug Discovery Today d Volume 28, Number 1 d January 2023

2. Minglei Li, Ying Zhi, Bo Liu, and Qingqiang Yao, Advancing Strategies for Proteolysis-Targeting Chimera Design, J. Med. Chem. 2023, 66, 2308−2329

3. Klein VG, Bond AG, Craigon C, et al. Amide-to-ester substitution as a strategy for optimizing PROTAC permeability and cellular activity. J Med Chem. 2021;64(24):18082–18101

4. Hidetomo Yokoo, Mikihiko Naito and Yosuke Demizu, Investigating the cell permeability of proteolysis-targeting chimeras (PROTACs), EXPERT OPINION ON DRUG DISCOVERY

5. Dawei Hong, Bizhong Zhou, Bei Zhang, Hao Ren, Liquan Zhu, Guowan Zheng, Minghua Ge, Jingyan Ge, Recent advances in the development of EGFR degraders: PROTACs and LYTACs, European Journal of Medicinal Chemistry Volume 239, 5 September 2022, 114533.

6. Qingqing Pan, Yao Lu, Li Xie, Di Wu, Rong Liu, Wenxia Gao, Kui Luo, Bin He, and Yuji Pu, Recent Advances in Boosting EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors-Based Cancer Therapy, Mol. Pharmaceutics 2023, 20, 829−852.