01 PROTAC

蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC, Proteolysis-targeting chimera）技术在肿瘤治疗方面的应用价值已经深入人心。该技术的分子核心涉及能够同时募集E3泛素连接酶（E3）和目标蛋白（POI）的异双功能分子。在该异双功能药物的作用下（被称作PROTAC分子），一种三元复合物POI-PROTAC-E3随之形成，并且触发POI的泛素化，并诱导随后泛素-蛋白酶系统（UPS）介导的POI降解（图1）。

图1. PROTAC工作原理。（图片来源：International Journal of Molecular Sciences）

尽管PROTAC具有许多优点，但该技术仍然存在一些局限性。一个主要问题是PROTACs未能遵循Lipinski的五法则（Ro5），导致药物渗透性，溶解度和口服生物利用度差。另一个限制是PROTAC诱导降解的耐药性，这可能是由于募集E3连接酶表达不良，或者突变所导致的。第三个问题在于对正常蛋白的靶向所导致的毒性。

最近，基于前药的PROTACs（pro-PROTACs）的开发已成为一种有前途的策略，用于将活性PROTACs精确释放到肿瘤中，并最大限度地减少靶向组织外毒性（图2）。张翾团队在J Med Chem的综述Recent Advances in Pro-PROTAC Development to Address On-Target Off-Tumor Toxicity介绍了这方面的最新进展。

图2. Pro-PROTACS工作基本原理。（图片来源：J Med Chem）

02 基于受体介导的内化的Pro-PROTACs

细胞表面的各种膜蛋白受体可以特异性地与细胞外配体结合。Pro-PROTACs可以从这个方面入手，通过受体介导的内化而实现生物学功能。

2.1 降解剂-抗体偶联物（Degrader–Antibody Conjugates）

经典ADC（抗体药物偶联物）由单克隆抗体、细胞毒性有效载荷和连接它们的化学接头组成。ADC的单抗区域可以与细胞表面的肿瘤抗原结合，导致抗原介导的内吞作用。大多数ADC的有效载荷都是DNA损伤剂和微管蛋白抑制剂，类型较少，这可能导致耐药性和副作用。

降解剂-抗体偶联物（DAC）已成为一种降低传统PROTAC靶向的毒性的新方法。例如，GNE-987是一种非常有效的针对BET蛋白的PROTAC降解剂，具有不佳的体内PK特性。为了解决这一限制，研究者设计了一个DAC，名为CLL1-1 （药物：抗体（DAR）为6）（图3）：通过二硫醚衍生的碳酸酯接头将GNE-987与CLL1靶向抗体连接。值得注意的是， CLL1-1表现出了生物活性，而亲本PROTAC GNE-987则无活性。这证明了将非理想的PROTAC候选药物转化为DAC前药的潜力，不仅可以实现POI的肿瘤特异性降解，还可以克服那些非抗体偶联对应物的药代动力学问题。PROTACs与抗体偶联作用，通过后者介导的内化而充分实现靶蛋白降解的目的。

图3. DAC作用机制。（图片来源：J Med Chem）

2.2 叶酸介导的 PROTAC

叶酸受体α（FRα 或FOLR1）是抗癌药物递送中广泛认可的治疗靶点。与正常组织相比，叶酸受体在多种类型的肿瘤中过表达。利用这一特性，研究人员已经开发出几种将小分子抑制剂（SMI）与叶酸结合的前药。该策略已应用于Pro-PROTACs的设计中，以减轻PROTACs脱靶效应导致的毒性。

叶酸依赖型Pro-PROTACs，可用于靶向降解BRD，MEK和ALK等蛋白。偶联物9（图4）是通过三唑接头将叶酸连接到ARV-771（一种有效的BRD4蛋白 PROTAC）上的仲羟基产生的，通过FRα 介导的内化进入肿瘤细胞，并且随后被细胞中的内源性水解酶激活。

图4. （A）叶酸依赖型PROTACs工作原理；（B）Aptamer-PROTAC工作原理。（图片来源：J Med Chem）2.3 Aptamer–PROTAC 偶联物

核酸适配体（Aptamer）是合成的单链寡核苷酸，可与特定靶蛋白结合。作为一种“化学抗体”，核酸适配体表现出组织渗透率高、免疫原性低等明显优势。例如，AS1411是临床评估中最先进的核酸适配体，对核仁蛋白（也称为C23）具有特异性结合亲和力，并对核仁蛋白过度表达癌细胞具有有效的抗增殖活性。基于AS1411的药物-适配体偶联物已被广泛研究，以实现抗癌药物（如阿霉素）的肿瘤特异性递送。同样，适配体与PROTACs的偶联，可以增强母体PROTACs的肿瘤靶向能力和抗肿瘤功效。

研究者通过酯-二硫键接头将AS1411与MZ1连接，构建了一个适体-PROTAC偶联物（APC 13）（图4B）。理论上，在内化进入富含核仁蛋白的肿瘤细胞时，APC 13上的二硫键被丰富的内源性GSH选择性裂解，导致分子内环化以释放活性MZ1的PROTAC。APC 13在核仁蛋白阳性MCF-7细胞中表现出有效的BRD4蛋白降解，并且在MCF-7异种移植模型中表现出较强的抗肿瘤功效，而不会引起明显的副作用。因此，Aptamer-PROTAC偶联物具有克服传统PROTAC局限性的潜力。

03 光活化的PRO-PROTACs

光是一种特殊的外部控制剂，具有高空间和时间分辨率。光活化Pro-PROTACs为致病蛋白的靶向降解开辟了新的可能性。这些光活化Pro-PROTACs可大致分为两类：光笼式（photocaged）和光开关（photoswitchable）PROTAC。

3.1  光笼式PROTACs

光笼式PROTAC通常涉及将光裂解基团掺入母体PROTAC中，在没有光的情况下避免对POI或E3的结合亲和力。活性PROTAC在光照射下迅速释放，诱导POI降解。

图5. 光笼式PROTACs工作原理。（图片来源：J Med Chem）

研究者将4,5-二甲氧基-2-硝基苄基（DMNB）基团引入dBET1（一种有效的BET蛋白降解剂）的BRD结合区，以此设计了BRD4靶向光笼PROTAC 14（图5）。化合物14中的DMNB部分阻碍了它与BRD4在没有光照射的情况下的结合能力（这是光笼式PROTACs的前提，也是稳定性的内在需要）。然而，在用365nm的紫外光照射时，结合亲和力得以实现，并导致Ramos细胞中的BRD4降解。

3.2  光开关PROTACs

与大多数传统的protac前体不同，光开关的PROTACs（photoPROTACs）使用含偶氮的接头，而不是烷基或聚醚接头，来连接POI弹头和E3配体。因此，在指定波长的光照射下，photoPROTACs可以在“顺式”和“反式”构型之间有效转换。由于POI弹头与E3配体之间的拓扑距离和构象的显著变化，导致该pro-PROTAC不同的生物活性。因此和光笼式PROTACs的光裂解模式不同，光开关PROTACs利用的是光敏化合物空间构型在光照条件下的变化，从而实现化合物激活的目的。

图6. 光开关PROTACs工作原理。（图片来源：J Med Chem）

研究者将光开关基团引入基于VHL的PROTAC中。PhotoPROTAC trans-21（图6）是通过用双稳态邻位-F4-偶氮苯接头实现功能的。PhotoPROTAC trans-21（反式）显著诱导了Ramos细胞中BRD2的降解，同时保留了BRD4。相比之下，cis-21（顺势）表现出较短的拓扑接头长度，这导致BRD2降解失活。两种异构体在530和415 nm照射下实现了高效转化。

04 其它模式的Pro-PROTACs

4.1硝基还原酶 （NTR, Nitroreductase） 响应性 PROTAC

缺氧 (hypoxia) 是许多实体瘤的显著特征，与耐药性和预后不良相关。在常氧条件下，缺氧实体瘤的硝基还原酶（NTR）表达高于健康组织，这使得基于NTR的前药在肿瘤细胞和正常细胞之间具有良好的选择性。Evofosfamide（Evo或TH-302）是一种含有2-硝基咪唑部分的NTR激活前药，在临床试验中显示出良好的安全性和抗肿瘤活性。因此，在癌症治疗中利用缺氧的NTR反应性PROTACs，有望拓宽传统PROTACs的治疗窗口。

图7. NTR-响应性PROTACs工作机理。（图片来源：J Med Chem）

研究者设计了一系列针对表皮生长因子受体（EGFR）的缺氧激活PROTACs（ha-PROTACs）。在gefitinib衍生的EGFR降解剂上，将缺氧激活的离去基团（HALG）引入4-NH位置，产生前体27和28（图7）。与母体化合物gefitinib相比，它们对EGFRDel19的结合亲和力显着降低。此外，28在HCC4006细胞的缺氧条件下显著诱导EGFRDel19降解（Pro-PROTAC被激活），但在常氧条件下没有。在没有NTR的情况下，27和28均稳定，而在与NTR孵育20分钟后，观察到活性PROTAC的释放。因此，该研究为肿瘤靶向前PROTAC开发提供了一种新的策略。

4.2 放射治疗触发的 PROTAC（RT-PROTAC）

放射治疗使用高能X射线破坏癌细胞，是癌症的一线治疗方法。X射线和活性药物的协同作用可能达到优越的抗肿瘤效果。

图8. （A）放射疗法触发的PROTACs；（B）ROS-响应性PROTACs。（图片来源：J Med Chem）

在一项研究中，研究者开发了一种放射治疗触发的PROTAC（RT-PROTAC）。在X射线辐射下，RT-PROTAC 31上的苯基叠氮化物基团（图8A）被还原为苯胺，触发随后的1,6-苄基消除和脱羧。活性PROTACs的形成不仅导致BRD4和BRD2在体内降解，而且在MCF-7异种移植模型中表现出与X射线的协同作用。提高了常规PROTACs的抗肿瘤疗效，降低了其不良的全身毒性。

4.3 活性氧 （ROS） 响应性 PROTAC

ROS（Reactive Oxygen Species）是一系列氧化剂，包括过氧化氢（H2O2），超氧自由基和羟基自由基，它们在正常细胞中含量较低，但在肿瘤中经常升高。因此，由ROS激活的前药可以选择性地靶向肿瘤细胞，而对健康组织毒性较低。

研究者开发了一种ROS响应性PROTACs，招募CRBN E3连接酶，用于选择性降解BRD3蛋白。前药32（图8B）是通过在lenalidomide片段的芳香胺基上引入芳基硼酸而设计的。当用H2O2处理时，pro-PROTAC 32转化为苯酚衍生的中间体，并随后经历1,6-苄基消除以释放活性PROTAC。此外，32在肿瘤细胞中表现出优于正常细胞的选择性降解活性。

结论

由不同机制激活的Pro-PROTACs的进步，使得强效降解剂能够靶向并递送到特定的组织或细胞中，从而减少药物暴露于健康器官，并改善传统PROTACs的治疗窗口。

Pro-PROTACs还面临着众多挑战。对于受体介导的内化的Pro-PROTACs，通过使用内体途径可以改善其细胞渗透，并且通过静脉注射可以优化其PK特征。由于其结构复杂性，优化和制造这些pro-PROTACs面临重大挑战。相比之下，与母体降解剂相比，其他具有较大分子量的Pro-PROTACs可能细胞膜通透性较差。这些分子的分子尺寸增加、可旋转键和固有的不稳定性也会对其PK特征产生负面影响。解决Pro-PROTACs的刚性问题，特别是在其接头区域，可能会带来更好的体内性能。

对于光活化的PROTACs，所需的照射波长可能导致DNA损伤，并且由于组织穿透能力低而限制了皮肤癌和血癌的应用。研究可以使用近红外光激活的新型光敏化合物进一步拓宽潜在的临床应用。

还有许多其他潜在机理可用于开发肿瘤靶向PROTAC。使用类似的策略，也可以开发用于治疗癌症以外疾病的Pro-PROTAC。总体而言，新型Pro-PROTACs的深度开发有望减轻潜在的靶向毒性，该领域的协同努力将会推动PROTAC技术的临床应用。

Ref.

Chen, C. et al. Recent Advances in Pro-PROTAC Development to Address On-Target Off-Tumor Toxicity. J. Med. Chem. 2023. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.3c00302