FDA日前发布了药物基质亚硝胺杂质（NDSRI, Nitrosamine Drug Substance-Related Impurities）允许摄入量设定的指南文件：Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug-Substance-Related Impurities（NDSRIs）Gudiance for Industry，为工业界极其关注的NDSRI杂质阈值含量的设定做出了关键性的指导。

1 亚硝胺杂质背景介绍

2018年，在沙坦类药物的亚硝胺致癌杂质NDMA（二甲基亚硝胺）事件爆发之后，FDA和EMA等监管机构就一直在强调原料药与成品药生产过程中，对于亚硝胺杂质的质量控制的必要性。它们一再出台并更新相关的指南，责令各制药公司和CDMO加强亚硝胺杂质的控制管理。

FDA对于亚硝胺杂质监管要求大致可以分为两个时期：在最初的阶段，由于受到沙坦等药物NDMA污染的影响，FDA的目光主要投在这类单纯亚硝胺杂质的管理方面。也就是说，FDA在这一阶段非常关注药品生产过程中，试剂之间，或者试剂与杂质之间（沙坦类药物的NDMA污染，就是亚硝酸盐与二甲基甲酰胺溶剂中的二甲胺杂质之间的反应所导致的）的反应所导致的小分子亚硝胺杂质。这些单纯亚硝胺杂质的致癌性与致畸性已经得到了充分的研究，它们的AI（允许摄入量，Acceptable Intake）值已经得到了明确的规定。例如NDMA的AI值为96 ng/天，NDEA的AI值为26.5 ng/天。表1标注了最常见的六种FDA认定的单纯亚硝胺杂质，它们的化学结构，以及FDA规定的AI值。

表1. FDA认定的6种可能存在于药品中的单纯亚硝胺杂质

在第二阶段，FDA与EMA的着重点转移到了所谓的NDSRI（药物基质亚硝胺杂质，nitrosamine drug substance related impurities）。这是一个政策紧缩的标志。

2 何谓NDSRI

与单纯亚硝胺杂质不同，NDSRI指的是那些药物分子本身参与亚硝胺杂质形成的类型。这些药物中通常都含有二级胺（包括叔胺）结构，为亚硝胺的形成提供了氨基单元。例如治疗帕金森病的药物雷沙吉兰（Rasagiline，商业名称：Azilect®）中发现的亚硝胺类杂质，N-亚硝基雷沙吉兰；以及在治疗动脉硬化、自发的和脑炎性的帕金森病的药物奥芬那君（Orphenadrine）中发现的N-亚硝基奥芬那君（叔胺也能引发亚硝胺形成的完美案例, 图1）。后者引发了Sandoz 13个批次的药品召回。相对于NDMA和NDEA这样的单纯亚硝胺杂质，这些产品相关的亚硝胺杂质的上限值被指定得非常低。

图1. 雷沙吉兰和奥芬那君以及它们的N-亚硝基杂质

3 NDSRI杂质何以引发争议

在缺少足够的数据支持的情况下，FDA与EMA在NDSRI杂质的AI设定上，起初非常保守。

EMA在去年九月份发布了针对特定药品的亚硝酸杂质NDSRI限制指南，其中囊括了许多易感药物。该指南对这些易感药物的亚硝胺杂质NDSRI上限提出了建议。指南规定，如果某种药物已形成亚硝胺类杂质NDSRI，但具体限值没有在此份指南中限定的话，将统一采取18 ng/天的AI标准。FDA当时采纳的标准相对宽松，为26.5 ng/天，但ANVISA（巴西国家卫生监督局）, Health Canada（加拿大卫生部）， TGA（澳大利亚药品管理局）等监管机构都遵循EMA的18 ng/天的限值标准。

在没有数据支持的情况下限定18 ng/天这样极低的NDSRI上限，引发了很多制药行业人士的关注。药物基质亚硝胺杂质NDSRI的主要产生阶段，其实并不在原料药的合成部分，毕竟使用nitrosating为原料的合成路线并不多，而且需要酸性条件，再考虑生产过程中的purging步骤，形成药物基质亚硝胺NDSRI的可能性并不大。

真正的考验在于制剂阶段，对于那些含有二级胺结构的药物来说，可谓如履薄冰了。一些赋形剂，以及铝膜，印刷油墨中可能会含有亚硝酸盐类的物质或杂质，包括水中也含有亚硝酸盐（但水带来的风险极低），因此在制剂过程，储存，包装中可能产生药物基质亚硝胺NDSRI。如果对其指定18 ng/天的AI标准，对于那些剂量极大的药物来说，就有些难以承受之重的意味。

我们可以想象一个1 g剂量的片剂，形成分子量460的NDSRI, 按照18 ng/天的标准，那么该制剂中亚硝酸盐（分子量46）杂质的浓度需要低于18 ng *（46/460）=1.8 ppb, 或者0.0018 ppm，才能保证绝对的安全，而这种标准对于赋形剂制造商来说几乎是不可能完成的任务。考虑到制剂中药物分子本身的含量对于亚硝酸盐杂质含量的绝对优势，这样的估算并不是没有道理的。退一步讲，如果只有10%的亚硝酸盐最终将药物分子降解为相应的亚硝胺NDSRI，那么赋形剂中的亚硝酸盐也需要控制在0.018 ppm以下，这同样是很难实现的质量标准。要知道赋形剂亚硝酸盐杂质通常采用的限值为小于等于1 ppm，将这个标准提高（紧缩）100到1000倍，对制造商的挑战可想而知。

监管部门指定的18 ng/天的NDSRI最高限值对于制药行业，尤其是分子结构中含有二级胺的药品生产，会产生极大的影响。按照这样的标准控制赋形剂，水和其它相关成分中的亚硝酸盐含量，对于赋形剂供应商和药物制造商来说，无论从工艺本身还是分析手段的开发来讲都是一件非常困难的挑战。有专家甚至直言不讳，这样的AI标准对于很多药物来说几乎是不可能实现的。

亚硝胺本身并不直接致癌或至突变，直接产生致癌性的是某些特定亚硝胺在体内产生的碳正离子。如图2所示，摄入体内的亚硝胺类物质1，在细胞色素P450（cytochrome P450）的作用下被氧化为α-羟基亚硝胺 2 （此过程需要亚硝胺底物含有Hα，没有Hα的取代亚硝胺不发生这个羟基化过程，因此可能不具诱变性及致癌性）。后者通常不稳定，消除一个醛分子并转化为1-羟基-2-烷基二亚胺3。化合物3经过脱水产生烷基叠氮盐（diazonium）4，这个不稳定的叠氮盐在释放一分子氮气后转化为高活性的碳正离子5。在这个过程种形成的碳正离子，可以说是亚硝胺化合物遗传毒性和致癌性的直接凶手，而亚硝胺（或者后退一步，亚硝酸盐），可被视为元凶。碳正离子5可以与体内的DNA上碱基反应，从而激活其致癌性。

图2. 亚硝胺体内转化为叠氮盐和碳正离子的生物化学过程

相对与NDMA， NDEA等小分子亚硝胺，药物分子形成的亚硝胺杂质NDSRI的反应活性应该与其有一定差距。因此工业界很多专家都在质疑，18 ng/天的强制标准是否合理？他们最主要的论据就是这些NDSRI相对于NDMA, NEDA可能致癌物来说，是否真的是一种潜在的危险？

4 FDA做出让步，公布NDSRI最新AI指南

面对工业界的质疑甚至反对声音，FDA日前公布了NDSRI杂质AI上限设定的指南意见，对AI值未设定的NDSRI杂质的AI设定流程进行了重要的变更。

在该指南文件中，FDA承认并非所有NDSRI杂质都具有相同的致癌性和致畸性（从目前的数据来看，不同亚硝胺分子的致癌性之间存在四个数量级的差异），这主要取决于它们具体的化学结构。AI值的设定，应该考虑这些亚硝胺分子化学结构。

在新的指南文件中，FDA凭借NDSRI分子结构中的活化结构特征（Activating structural features）以及去活化结构特征（deactivating structural features），来预测这些分子的致癌性，并在这个基础上给它们设定相应的AI值。

在预测NDSRI的致癌性过程中，FDA采纳图2中描述的致癌性机理，认为亚硝胺物质的致癌性，源于其代谢过程中的α-碳原子的羟基化，以及在这个基础上所形成的碳正离子物质。

指南中认定的具有潜在致癌性的亚硝胺化合物，是那些在亚硝胺基团的两侧都结合有一个碳原子的结构（即α-碳原子，图3），而这些碳原子并不直接通过双键与杂原子相连接（例如N-亚硝基酰胺、N-亚硝基胍和其它类似的分子，都排除在此指南之外）。

图3.致癌性相关的NDSRI的结构示意图

而且亚硝胺基团不可以被整合入芳香环结构之内（例如亚硝基吲哚，图4）。如果一个分子内同时含有两个亚硝胺基团，那么整个分子的AI值由致癌性更高的那个亚硝胺基团决定。

图4. N-nitrosoindole化学结构

5 NDSRI杂质的AI设定建议

在这份指南中，FDA对于NDSRI杂质的AI值建立了5个活性级别（Potency Category），对应不同的AI值（注意: 级别数越高，其致癌性越低，AI值也就越高；第4级和第5级AI值相同，均为1500 ng/天）。其标准与设定如表2所显示。

表2. FDA建议的NDSRI五档标准与AI设定

该指南的核心内容，在于如何通过NDSRI的化学结构认定它们的活性级别，从而确定其AI值。这个标准见图5：

图5.化学结构为基础的NDSRI活性级别以及AI设定流程图（活性指数的指定方法见后文）

6 活性指数计算方法

图5中涉及到的活性指数，是FDA指南文件中的另一个核心内容，直接关联AI值设定的中心问题。需要注意的是，活性指数的数值越低，其致癌性就越高，所对应的AI值就越低。

FDA指南文件中的活性指数的数值，是由三部分单独的数值贡献叠加在一起的：

α-氢指数

去活化特征指数

活化特征指数

即：活性指数= α-氢指数+去活化特征指数（NDSRI中符合该特征的所有指数的加合）+活化特征指数（NDSRI中符合该特征的所有指数的加合）

α-氢指数

α-氢指数由NDSRI分子中α-氢的数量决定，其计算方法见表3：

表3. α-氢指数表计算方法

* α-氢指数等于3的示例仅仅局限于所涉及的亚甲基α-碳不隶属于乙基；如果其隶属于乙基，那么α-氢指数应被设定为2，而不是3。

去活化特征指数

去活化特征指数计算方法与示例见表4。需要指出的是，去活化特征可以降低NDSRI的致癌性，其数值为正值，因为活性指数越高，致癌性越低。

表4.去活化基团与去活化特征指数的关联（计算去活化特征指数时，每个去活化特征对应的指数进行加合，但每项去活化特征只可计算一次）

**不包括羧基与芳基（单独计算），以及酮基***β-碳必须为sp3杂化

活化特征指数

活化特征指数计算方法与示例见表5。需要指出的是，活化特征可以增加NDSRI的致癌性，其数值为负值，因为活性指数越低，致癌性越高。

表5.活化基团与活化特征指数的关联（计算活化特征指数时，每个活化特征对应的指数进行加合，但每项活化特征只可计算一次）

NDSRI活性指数计算示例

示例1显示了NDSRI，即N-Nitroso-L-nebivolol的活性指数计算方法：

示例2的NDSRI为N-nitroso-ketamine

原文链接：https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/updated-information-recommended-acceptable-intake-limits-nitrosamine-drug-substance-related